Zellkultur Bioassays - cell-based assays - Überblick
Was sind Bioassays?
Bioassays oder cell-based assays sind experimentelle Verfahren zur Bestimmung der biologischen Wirkung von Substanzen auf lebende Systeme wie Zellen, Gewebe oder Organismen. Im Gegensatz zu rein chemischen Analysen erfassen sie funktionelle Effekte und liefern damit biologisch relevante Informationen. Sie sind sowohl in der Forschung als auch im Pharmabereich z.B. als Freigabeassays (release assays) im Bereich GMP mittlerweile unersetzlich. Vor allem Wirksamkeitsprüfungen (potency assays) sind häufig cell-based assays.
Es gibt verschiedenste Arten von Bioassays, die grundlegend (Zellzahl, Zelltod, Metabolismus) oder spezifisch (bestimmte Rezeptoren, Kaskaden) sein können. Die Auswertung kann über Absorption, Fluoreszenz, Lumineszenz, Mikroskopie oder Impedanz erfolgen. Manche Assays sind sogenannte Endpunktassays, andere sind kontinuierlich. Auf dieser Seite versuchen wir einen Überblick über Vor- und Nachteile von verschiedenen Assaytypen, Messprinzipien und speziellen Assays zu geben.
Diese InCelligence-Seite beinhaltet:
- Was sind Bioassays?
- Wo und wofür werden Bioassays verwendet?
- Bioassays in unseren Fortbildungen und unsere Bioassay-Beratung
- Welche Arten von Bioassays gibt es: Endpunkt vs. kontinuierliche Assays
- Welche Assays zur Bestimmung der Zellzahl gibt es?
- Welche Cytotoxizitätsassays gibt es?
- Welche Proliferationsassays gibt es?
- Welche Apoptoseassays / Zelltod-Assays gibt es?
- Was sind die Vor- und Nachteile von einzelnen Assays - Vergleich von Assaysystemen
InCelligence-Kurse zum Thema:
Wo und wofür werden Bioassays verwendet?
Typische Anwendungsgebiete sind:
- Pharmaforschung und Wirkstoffentwicklung
- Identifikation und Charakterisierung neuer Wirkstoffe
- Bestimmung von Wirksamkeit (Potenz, EC50/IC50)
- Toxizitätsscreening
- Toxikologie und Sicherheitsbewertung
- Bewertung von Chemikalien, Umweltgiften und Kosmetika
- Risikobewertung für Mensch und Umwelt
- Biotechnologie und Qualitätskontrolle
- Prüfung biologischer Produkte (z. B. Antikörper, Impfstoffe)
- Chargenkontrolle und Stabilitätsuntersuchungen
- Grundlagenforschung
- Untersuchung zellulärer Signalwege
- Analyse von Zellverhalten (Wachstum, Differenzierung, Tod)
Bioassays in unseren Fortbildungen und unsere Bioassay-Beratung
Aussagekräftige und reproduzierbare Ergebnisse hängen dabei nicht nur von der Wahl des geeigneten Assays ab, sondern auch von der Qualität der verwendeten Zellen, standardisierten Kulturbedingungen, geeigneten Kontrollen und einer reproduzierbaren Durchführung. Diese Themen behandeln wir sowohl in unseren Fortbildungen als auch im Rahmen unserer individuellen Beratung.
- Zellanalyse & Bioassay – Kurse und In-house Schulungen – Übersicht über unsere Fortbildungen im Bereich Zellanalyse und Bioassays. Die Themen reichen von Zellkultur und Standardisierung über Zellzählung, Vitalität, Proliferation und Cytotoxizität bis hin zu Mykoplasmennachweis, Geräteprüfung und Qualitätsmanagement im Bioassaylabor.
- Zellkultur Bioassays (Basis bis GMP) – Praxisorientierter Kurs zur Etablierung, Optimierung und zum Trouble Shooting zellbasierter Bioassays. Behandelt werden unter anderem Zellqualität, Cell Banking, Medien und FCS, Zellkulturplastik, Inkubatoren, Pipettieren, Standardisierung, Kontrollen sowie praktische Bioassay-Methoden.
- Zellkultur Bioassay-Methoden (cell-based Assay-Methoden) – Vertiefender Kurs zu verschiedenen Methoden zellbasierter Assays. Schwerpunkte sind unter anderem Assays zu Zellwachstum, Apoptose und Zell-Matrix-Interaktionen sowie immunbiologische Zelltests und Methoden zur Untersuchung der zellulären Signaltransduktion.
- Beratung für Zellkultur, Bioassays und Qualitätsmanagement – Für individuelle Fragestellungen unterstützen wir Labore und Unternehmen auch projektbezogen bei der Entwicklung, Optimierung, Standardisierung und dem Trouble Shooting zellbasierter Bioassays. Die Beratung kann unter anderem die Auswahl geeigneter Zellen, Endpunkte und Detektionsmethoden, die Festlegung sinnvoller Kontrollen, die Optimierung von Assaybedingungen sowie Methodenvalidierung und Methodentransfer umfassen.
Damit bietet InCelligence sowohl strukturierte Schulungen für den Einstieg und die methodische Vertiefung als auch individuelle Unterstützung bei konkreten Bioassay-Projekten – von der Auswahl einer geeigneten Methode bis zur Entwicklung, Optimierung und Standardisierung bestehender Assays.
Welche Arten von Bioassays gibt es: Endpunkt vs. kontinuierliche Assays
Bioassays lassen sich grundsätzlich in zwei Kategorien einteilen:
- Endpunkt-Assays
- Kontinuierliche (kinetische) Assays
Endpunkt-Assays
Endpunkt-Assays messen die biologische Antwort zu einem definierten Zeitpunkt.
Eigenschaften:
- Messung erfolgt einmalig nach Inkubation
- Einfach durchzuführen und gut standardisierbar
- Oft hohe Reproduzierbarkeit
Beispiele:
- WST-8, WST-1; XTT- und MTT-Assay
- Neutral Rot, Kristallviolett Assays
- LDH- oder Protease-Freisetzungsassay
- Caspase-Endpunktmessung
Vorteile:
- Geringer technischer Aufwand
- Hoher Durchsatz (High-Throughput-Screening geeignet)
Nachteile:
- Keine Information über zeitliche Dynamik
- Kritisch bei zeitabhängigen Prozessen
Kontinuierliche (kinetische) Assays
Diese Assays erfassen die biologische Reaktion über einen Zeitraum hinweg kontinuierlich bzw. sehr engmaschig.
Eigenschaften:
- Mehrfache Messung desselben Samples über die Zeit (Kinetik)
- Echtzeit- oder zeitaufgelöste Daten
Beispiele:
- Live-Cell Imaging
- Impedanzbasierte Zellanalyse (z. B. xCELLigence)
- Fluoreszenz-Reporter-Assays
Vorteile:
- Darstellung von Dynamiken (z. B. Wachstumskurven)
- Höhere Informationsdichte
Nachteile:
- Höherer technischer Aufwand
- Datenanalyse komplexer
Welche Assays zur Bestimmung der Zellzahl gibt es?
Zellzahlassays dienen der Quantifizierung lebender oder gesamter Zellen in einer Probe. Sie basieren auf unterschiedlichen biologischen oder physikalischen Prinzipien. Die Zellzählung ist hier am präzisesten, aber auch sehr aufwendig. Andere Assays ermitteln die Zellzahl indirekt, was fehleranfällig ist.
Übersicht der Assaytypen und Prinzipien
|
Assaytyp |
Beispiel |
Prinzip |
| Zellzählung | Zellzählung im Counter, Trypan Blau, Eosin B | Direkte und damit präziseste Methode. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden. |
|
Metabolische Aktivität |
MTT, XTT, WST-1, WST-8, Resazurin (Alamar Blue) |
Indirekte Messung. Reduktion von Farbstoffen durch mitochondriale oder cytoplasmatische Enzyme in lebenden Zellen. Die metabolische Aktivität korreliert mit der Zellzahl. |
| Membranintegrität der Lysosomen | Neutral Rot | Indirekte Messung der lysosomalen Funktion. Nach OECD wird Neutral Red im Neutral Red Uptake (NRU) von aktiven Zellen aufgenommen und in den Lysosomen angereichert. In der von InCelligence verwendeten Variante werden die Zellen zunächst mit Neutral Red beladen, danach wird das Medium gewechselt. Die anschließende Abgabe von Neutral Red in das Medium korreliert mit der Zellschädigung; entsprechend nimmt die in intakten Zellen zurückgehaltene Farbstoffmenge ab. |
|
ATP-basierte Assays |
CellTiter-Glo |
Indirekte Messung. Lumineszenz proportional zur ATP-Konzentration als Maß für lebende Zellen |
|
DNA-Menge |
Hoechst, PicoGreen |
Indirekte Bestimmung der Zellzahl. Fluoreszenzfarbstoffe binden an DNA; die gemessene DNA-Menge korreliert innerhalb des geeigneten Messbereichs mit der Zellzahl |
|
Proteinquantifizierung |
SRB (Sulforhodamin B) |
Indirekte Messung, Bindung an Zellproteine → Gesamtzellmasse |
|
Impedanzmessung |
Real-Time Cell Analysis |
Indirekte Messung. Änderung des elektrischen Widerstands durch adhärente Zellen |
|
Bildbasierte Verfahren |
Mikroskopie + Software |
Direkte Zellzählung über Bildanalyse |
Welche Cytotoxizitätsassays gibt es?
Cytotoxizitätsassays messen die Reduktion lebender oder die Zunahme toter Zellen, um das toxische Potential von Substanzen zu ermitteln.
Übersicht der Assaytypen und Prinzipien
|
Assaytyp |
Beispiel |
Prinzip |
| Zellzählung | Trypan Blau, Eosin B; Zellzählung im Counter | Direkte und damit präziseste Methode. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden. |
|
Metabolische Aktivität |
MTT, XTT, WST-1, WST-8, Resazurin (Alamar Blue) |
Indirekte Messung. Reduktion von Farbstoffen durch mitochondriale oder cytoplasmatische Enzyme in lebenden Zellen. Die metabolische Aktivität korreliert mit der Zellzahl. |
| Membranintegrität der Lysosomen | Neutral Rot | Indirekte Messung der lysosomalen Funktion. Nach OECD wird Neutral Red im Neutral Red Uptake (NRU) von aktiven Zellen aufgenommen und in den Lysosomen angereichert. In der von InCelligence verwendeten Variante werden die Zellen zunächst mit Neutral Red beladen, danach wird das Medium gewechselt. Die anschließende Abgabe von Neutral Red in das Medium korreliert mit der Zellschädigung. |
| LDH-Freisetzung | LDH-Assay | Indirekte Messung. Sterbende Zellen setzen LDH frei. Die Aktivität von LDH (Laktatdehydrogenase) im Medium kann gemessen werden. |
|
ATP-Abnahme |
CellTiter-Glo |
Indirekte Messung. Abnahme von ATP zeigt Zellsterben |
Welche Proliferationsassays gibt es?
Proliferationsassays messen die Zunahme lebender Zellen, um das proliferationsfördernde Potential von Substanzen zu ermitteln.
Übersicht der Assaytypen und Prinzipien
|
Assaytyp |
Beispiel |
Prinzip |
| Zellzählung | Trypan Blau, Eosin B; Mikroskopie, Zellzählung über automatisierte Counter | Direkte und damit präziseste Methode. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden. Bei Mikroskopen manchmal schwierig, wenn die Zellen kontrastarm sind |
|
DNA-Synthese |
BrdU, EdU |
Direkter Assay, präzise, Einbau in neu synthetisierte DNA, damit wird die tatsächliche Proliferation über die Rate an DNA-Synthese gemessen |
|
Klonogenität |
Colony Formation Assay |
Direkte Messung. Fähigkeit zur Bildung von Zellkolonien |
|
Metabolische Aktivität |
MTT, XTT, WST-1, WST-8, Resazurin (Alamar Blue) |
Indirekte Messung. Reduktion von Farbstoffen durch mitochondriale oder cytoplasmatische Enzyme in lebenden Zellen. Die metabolische Aktivität korreliert mit der Zellzahl. |
| Membranintegrität der Lysosomen | Neutral Rot | Nach OECD wird Neutral Red im Neutral Red Uptake (NRU) von aktiven Zellen aufgenommen und in den Lysosomen angereichert. Die zurückgehaltene Farbstoffmenge kann als indirektes Maß für die viable Zellmasse verwendet werden. In der von InCelligence verwendeten Variante werden die Zellen zunächst mit Neutral Red beladen, danach wird das Medium gewechselt; die anschließende Abgabe von Neutral Red in das Medium korreliert mit der Zellschädigung. |
|
ATP-basierte Bestimmung der viablen Zellmasse |
CellTiter-Glo |
Indirekte Messung. Der ATP-Gehalt korreliert mit der viablen Zellmasse und kann innerhalb eines geeigneten Messbereichs zur Bestimmung von Zellzunahme bzw. Proliferation verwendet werden. |
Welche Apoptoseassays / Zelltod-Assays gibt es?
Apoptoseassays messen die Zunahme toter Zellen oder spezifische Endpunkte, die für Apoptose spezifisch sind, um das cytotoxische Potential von Substanzen zu ermitteln.
Da einzelne Apoptosemarker nicht in jedem System vollständig spezifisch sind, ist für eine belastbare Zuordnung häufig die Kombination mehrerer Endpunkte sinnvoll.
Übersicht der Assaytypen und Prinzipien
|
Assaytyp |
Beispiel |
Prinzip |
| Zellzählung | Trypan Blau, Eosin B; Mikroskopie, Zellzählung über automatisierte Counter | Direkte und damit präziseste Methode. Detektiert Zelltod, nicht nur Apoptose. Zellen werden im Counter gezählt. Lebende und tote Zellen können durch Farbstoffe unterschieden werden. Bei Mikroskopen manchmal schwierig, wenn die Zellen kontrastarm sind |
|
Caspase-Aktivität |
Caspase-3/7 Assay |
Direkter Assay. Detektiert nur Apoptose, nicht Nekrose. Aktivierung von Apoptose-Enzymen |
|
Membranveränderung |
Annexin V |
Direkter Marker für Phosphatidylserin-Exposition. Annexin V bindet an exponiertes Phosphatidylserin; zur Unterscheidung früher apoptotischer von spätapoptotischen bzw. membrangeschädigten Zellen wird Annexin V typischerweise mit einem Membranintegritätsmarker wie PI kombiniert |
|
DNA-Fragmentierung |
TUNEL |
Direkter Nachweis von DNA-Strangbrüchen bzw. DNA-Fragmentierung, die für Apoptose typisch sein kann. TUNEL ist jedoch nicht in jedem System ausschließlich apoptosespezifisch und kann auch bei anderen Formen ausgeprägter DNA-Schädigung positiv ausfallen. |
|
Mitochondrien |
JC-1, TMRE |
Indirekter Assay. Veränderung des Membranpotentials im Mitochondrien ist der Endpunkt. |
|
Zellmorphologie |
Mikroskopie |
Indirekte Methode. Schrumpfung, Membranblebbing werden detektiert. |
| Membranintegrität der Lysosomen | Neutral Rot | Indirekter Assay, detektiert Zellschädigung bzw. Zelltod, nicht spezifisch Apoptose. Nach OECD wird Neutral Red im Neutral Red Uptake (NRU) von aktiven Zellen aufgenommen und in den Lysosomen angereichert. In der von InCelligence verwendeten Variante werden die Zellen zunächst mit Neutral Red beladen, danach wird das Medium gewechselt; die anschließende Abgabe von Neutral Red in das Medium korreliert mit der Zellschädigung. |
| LDH-Freisetzung | LDH-Assay | Indirekter Assay, detektiert Zelltod, nicht nur Apoptose. Sterbende Zellen setzen LDH frei. Die Aktivität von LDH (Laktatdehydrogenase) im Medium kann gemessen werden. |
|
ATP-Abnahme |
CellTiter-Glo |
Indirekter Assay, detektiert Zelltod, nicht nur Apoptose. Abnahme von ATP zeigt Zellsterben |
Was sind die Vor- und Nachteile von einzelnen Assays - Vergleich von Assaysystemen
|
Assay |
Vorteile |
Nachteile |
Sensitivität |
Kosten |
HTS geeignet |
| WST-8 | Einfach, wasserlöslich, Phenolrot ist bei Blankmessung und Verrechnung nicht störend, es muss kein Mediumwechsel stattfinden, wenig cytotoxisch, sehr sensitiv, besser als WST-1, XTT, MTT | Endpunkt | Hoch | Mittel | Ja |
|
WST-1 |
Einfach, wasserlöslich, weniger sensitiv als WST-8, cytotoxischer als WST-8 |
Weniger sensitiv als ATP |
Mittel |
Niedrig–mittel |
Ja |
|
MTT |
Robust, weit verbreitet, günstig |
Endpunkt, toxisch, wasserunlösliches Endprodukt muss aufgelöst werden, mehr Schritte als WST-8 |
Mittel |
Niedrig |
Nein |
|
Resazurin (Alamar Blue) |
Nicht-toxisch, kinetisch messbar |
Signal abhängig vom Zelltyp |
Mittel–hoch |
Niedrig |
Ja |
|
LDH-Assay |
Einfach, schnell |
Hintergrundsignal möglich |
Mittel |
Niedrig |
Ja |
|
Trypan Blue |
Direkt, einfach |
Manuell, schlecht automatisierbar |
Niedrig |
Niedrig |
Nein |
|
BrdU |
Etabliert, spezifisch |
DNA-Denaturierung nötig |
Hoch |
Mittel |
Eingeschränkt |
|
EdU |
Schnell, keine Denaturierung |
Teurer |
Hoch |
Mittel–hoch |
Ja |
|
CellTiter-Glo (ATP) |
Sehr sensitiv, schnell |
Zelllyse nötig, kein Live-Monitoring |
Hoch |
Hoch |
Ja |
|
Colony Formation |
Goldstandard Langzeitwirkung |
Sehr zeitaufwendig |
Hoch |
Niedrig |
Nein |
|
Caspase 3/7 |
Spezifisch für Apoptose |
Nur Teil des Prozesses |
Hoch |
Mittel |
Ja |
|
Annexin V |
Frühmarker |
Kombination mit PI nötig |
Hoch |
Mittel |
Eingeschränkt |
|
TUNEL |
Direkte DNA-Fragmentierung |
Kann Nekrose mitmessen |
Hoch |
Mittel–hoch |
Eingeschränkt |
|
JC-1 / TMRE |
Frühe mitochondriale Effekte |
Sensitiv gegenüber Bedingungen |
Mittel |
Mittel |
Eingeschränkt |
|
Hoechst / PicoGreen |
Direkt DNA-basiert, stabil |
Misst auch tote Zellen |
Hoch |
Mittel |
Ja |
|
SRB |
Sehr reproduzierbar |
Mehr Schritte (Fixierung) |
Mittel |
Niedrig |
Eingeschränkt |
|
xCELLigence (Impedanz) |
Echtzeit, label-free |
Teure Geräte |
Mittel |
Sehr hoch |
Modellabhängig; ja bei RTCA HT |
|
Live-Cell Imaging |
Viele Parameter gleichzeitig |
Datenanalyse komplex, klappt nicht mit allen Zellen, Software-abhängig |
Hoch |
Sehr hoch |
Eingeschränkt |