Was ist bei einem Zellkultur-CO2-Inkubator wichtig: Übersicht und Vergleich

Natürlich soll ein Inkubator in der Zellkultur die Temperatur, Luftfeuchte und den CO₂-Gehalt regeln. Aber ist das schon alles? Nein! Es gibt viele Dinge, die man sich genauer ansehen sollte, ganz besonders dann, wenn man einen neuen Brutschrank kaufen möchte. Unsere Übersicht über die Kriterien und der Vergleich verschiedener Hersteller soll Ihnen hierbei helfen.

Welchen Stellenwert man den einzelnen Punkten bei der Kaufentscheidung einräumt, hängt auch davon ab, ob man in einem Forschungslabor arbeitet, in einem Testlabor oder ob man z.B. ein ATMP (advanced therapy medicinal product) oder TEP (tissue engineered medicinal product) herstellen möchte. Eine Gewichtung der Kaufkriterien,  die man unserer Meinung nach beim Vergleich der Hersteller berücksichtigen sollte, findet sich ganz am Ende dieser Seite.

Temperaturkonstanz und Erholung nach Türöffnung

Prinzip der Beheizung im Brutschrank

Temperaturbereiche von Brutschränken

Neben diesen Punkten sollte man noch darauf achten in welchem Temperaturbereich der Umgebung die Brutschränke arbeiten können. Zellkultur-Inkubatoren heißen nämlich auch Brutschränke, weil sie nur wärmen, aber im Normalfall nicht aktiv kühlen können. D.h. ein normaler Brutschrank benötigt eine Temperaturdifferenz von ca. 5-7 Grad zur Raumluft. In Laboren ohne Klimaanlage kann dies im Sommer durchaus ein kritischer Faktor sein, da durch Sonneneinstrahlung auf den Inkubator oder große Fenster im Labor an bestimmten Stellen im Labor Temperaturen deutlich erhöht sein können.

Das Prinzip der Befeuchtung

Damit während der Kultur der Zellen im Inkubator aus den Kulturschalen, -flaschen und Multiwells keine Flüssigkeit verdunstet, muss der Innenraum des Inkubators ca. 95 % Luftfeuchte aufweisen. Ansonsten werden die Zellen zwischen den Medienwechseln einem kontinuierlich zunehmenden osmotischen Stress ausgesetzt. Einen Vergleich der generellen Wege um den Inkubator-Innenraum effizient zu befeuchten, haben wir hier aufgeführt. Beim Inkubatorkauf ist wichtig, die Erholzeit nach Türöffnung zu erfragen und zu vergleichen. Bei alten Modellen kann eine lange Türöffnung Schwankungen bis zu 8 h nach sich ziehen.

CO₂-Gehalt und die Erholungszeit nach Türöffnung

 Für das Wachstum der Zellen im Zellkultur-Inkubator ist dieser Faktor derjenige über den man am meisten nachdenken sollte. Zum einen sollte der Inkubator den CO₂-Gehalt möglichst konstant halten und zum anderen sollte man dafür sorgen, dass möglichst wenig CO₂ verloren geht, indem man die Türen so kurz und so selten wie möglich öffnet. Geteilte und gut dichtende Türen sind hierbei ebenfalls wichtig (s.u.).

Die Regelung des pH-Werts im Medium

Der CO2-Gehalt im Inkubator sorgt dafür, dass im Zellkulturmedium der richtige pH-Wert eingestellt wird. Es besteht ein Gleichgewicht zwischen der Menge an Natriumhydrogencarbonat im Medium und CO2-Gehalt der Luft im Inkubator. Je höher der CO2-Gehalt, desto niedriger der pH-Wert. Gängige CO2-Gehalte für Zellkultur-Inkubatoren sind 5%, 8,4% oder 10%, je nach Medium, das verwendet wird. Im Verlauf der Kultur wird das Medium durch die sauren Abfallprodukte, die die Zellen ins Medium abgeben immer saurer. Wenn sich das Medium orange verfärbt hat, sollte meist ein Mediumwechsel vorgenommen werden, damit der pH-Wert nicht in unphysiologische Bereiche abfällt.
Messprinzip des CO2-Gehalts
Der CO2-Gehalt kann im Brutschrank über zwei Verfahren gemessen werden: TC (thermal conductivity) und IR (Infrarot) Sensoren. Heute sollte man nur noch Zellkultur-Inkubatoren mit dem schnelleren Infrarot-Messprinzip kaufen und darauf achten, dass es ein guter Sensor ist (Messzeit und Genauigkeit). TC Sensoren werden durch Schwankungen der Temperatur und Feuchte, die bei Türöffnungen entstehen, beeinflusst und sind deshalb im Vergleich langsamer und zeigen nicht die realen Werte in Echtzeit an. D.h. das Display sagt zwar: 5%, aber der reale Wert kann auch deutlich darunter liegen. Bei älteren Modellen mit TC Sensor ist die Erholungszeit daher zu lang und damit die pH-Wert Verschiebung für die Zellen größer bzw. länger. IR Sensoren dagegen reagieren im Vergleich schneller, da hier eine direkte Messung der CO2-Konzentration (unabhängig von den Umgebungsbedingungen: Temperatur und Luftfeuchtigkeit) erfolgt, sie zeigen Echtzeitwerte und sorgen damit auch für eine schnellere Erholung und eine präzisere Regulation des CO2-Gehalts. Außerdem gibt es Sensoren, die man im Brutschrank belassen kann während man ihn hitzedekontaminiert während man ältere Sensoren vor der Sterilisation ausbauen muss. Ersteres ist natürlich bequemer und schneller.
Konstanz des CO2-Gehalts bei der Kultivierung
Die Konstanz und die Erholungszeiten des CO2-Gehalts werden normalerweise gemäß der DIN-Norm für Inkubatoren gemessen und dann in Minuten angegeben. Hier muss man wissen, dass die DIN-12880-Reihe im Jahr 2007 geändert und aktualisiert wurde. Die neue Version heißt DIN 12880:2007-05. Wichtig hieran ist, dass die Messverfahren für die Erholung nach Türöffnung maßgeblich geändert wurden und daher beim Vergleich Messungen nach den neuen Vorgaben längere Erholungszeiten ausgeben. Diese Zeiten muss man unbedingt beim Hersteller erfragen, wenn man Inkubatoren vergleichen möchte.

Anzahl der Türen zur Schwankungsminimierung

Bei jeder Türöffnung entweicht CO2 und warme Luft. Je länger die Türöffnung anhält oder je größer die offene Fläche ist, desto größer wird die Schwankung im Inkubator. Dies stellt besonders dann ein Problem dar, wenn viele Personen sich einen Inkubator teilen, also die Türen häufig geöffnet werden. Andrerseits verliert der Brutschrank Gas durch die Dichtungen, auch wenn keine Türen geöffnet werden (vgl. Dichtigkeit der Türen). Daher ist es prinzipiell immer vorzuziehen, eine unterteilte Tür zu kaufen, wenn viele Personen einen Inkubator nutzen, außer man arbeitet mit Hypoxie (s.u.). Die geteilte Tür ist meist deutlich teurer, lohnt sich aber, weil die Konstanz zu besserer Vergleichbarkeit der Ergebnisse beiträgt. Diese Investition sollte man dann immer tätigen! Je nach Hersteller und Model gibt es Brutschranktüren ungeteilt, mit 2, 3, 4, 6 oder 8 Türen. Allerdings schränken die Türen die Beladungsmöglichkeiten ein. Daher können 4 Türen unter beiden Gesichtspunkten durchaus besser sein als 6 oder 8 Türen. Das Bild zeigt den alten New Brunswick Inkubator, der jetzt mit neuem Design (s.u.) von Eppendorf hergestellt wird.

Dichtigkeit der Türen

Ein Punkt bei dem man laufende Kosten verringern kann, ist die Dichtigkeit der Türen. Man sollte darauf achten, wie die Türenscharniere angebracht sind und wie leicht man sie beim Öffnen nach unten oder oben drücken kann. Im Gegensatz zum oberen Bild kann man hier sehen, dass die Scharniere über die gesamte Höhe der Tür gehen und mehrfach verschraubt sind. So sieht das hochwertige Scharnier des neuen Eppendorf Galaxy Inkubators (vorher New Brunswick) aus! Darüber hinaus sind Türen dichter, je weniger Unterteilungen es gibt. Dies ist besonders wichtig bei Inkubatoren, die mit Hypoxie gefahren werden. Für diese muss man genau überlegen, ob man geteilte Türen kaufen sollte. Eine beispielhafte Darstellung gibt die Tabelle für einige Binder Inkubatoren. Bei anderen Inkubatoren gilt jedoch analog das gleiche Prinzip.

Gasverbrauch pro Tag und pro Türöffnung im Vergleich für Binder Inkubatoren

Die Zahl unter break-even gibt im Prinzip an, ab wie vielen Türöffnungen pro Tag ein Inkubator mit geteilten Türen besser wäre. Je niedriger die Zahl, umso sinnvoller ist ein Brutschrank mit geteilten Türen. Hier zeigt sich deutlich, dass für Hypoxie fast immer ein Inkubator ohne Unterteilung besser ist.

Oberflächenmaterial

Ebenfalls wichtig für die Reinigbarkeit (nach DIN und GMP) ist das Material der Oberfläche. Hier gibt es:

+/-  Kupferinnenraum und Einlegeböden (anti-bakteriell, aber schwer zu reinigen da es rau wird, teuer, nur für universitäre Forschung)
  +  Edelstahl (gute Reinigbarkeit, da es sehr glatt ist, die Wahl für ATMP und TEP sowie Testlabore)
++  Kupfer/Edelstahllegierungen (ebenfalls anti bakteriell, aber trotzdem gut zu reinigen, also die beste Variante; allerdings teurer, daher GMP Produktion oder ATMP nach Prüfung)

Wir haben wegen der Reinigbarkeit hier klar Edelstahl als Favoriten.

Reinigbarkeit der Oberflächen (Risiken und Aufwand)

Dies ist ein Kriterium welches oft übersehen wird, aber großes Potential hat. Denn sind wir mal ehrlich, wie viel Spaß macht es, das innere Gestänge eines Inkubators auseinander zu bauen und dann einzeln zu reinigen? Hier gilt ganz klar - je weniger je besser. Das liegt an zwei Punkten: in Ritzen und Ecken können sich Keime ansiedeln und sind dort nur schwer zu entfernen beim Reinigen vor dem Desinfizieren werden Gestänge oft nicht wirklich sauber gemacht, weil es zu lange dauert

Reinigbarkeit: Worauf sollte man also achten?

• Innenraum ohne Schweißnähte, d.h. aus einem Stück gezogen (ein MUSS für ATMP und TEP)
• Abgerundete Ecken
• Türen ohne Schweißnähte
• Möglichst wenig Gestänge und Schrauben
• Leichte Demontage zur Reinigung (vor der Sterilisation: autoklavierter Schmutz ist eine Nährstoffquelle für neue Keime)

In unseren Augen die Nase vorn hat hier ganz klar Binder. Ihr Anti-Plenum Konzept ist bisher ungeschlagen, da der Inkubator gar kein Gestänge mehr hat, sondern nur noch die Einlegeböden. Auch der Eppendorf Inkubator ist mit einem sehr einfach und schnell zu demontierenden und zu reinigenden Gestell schon auf dem richtigen Weg.

Dekontaminations-Strategien Innenraum

Hier ist der Stand der Technik mittlerweile die automatische Dekontamination (sterile in place, SIP). Allerdings unterscheiden sich die Verfahren je nach Hersteller im Prinzip, der Temperatur und der Dauer:

Sterilisation: Vorgaben in Arzneibüchern und Normen

In Arzneibüchern wie den Pharmakopöen aus Europa, den USA, Japan etc. und den Normen zur Sterilisation werden die Begriffe Desinfektion und Sterilisation voneinander unterschieden. Desinfektion ist eine sogenannte Keimabreicherung also Verringerung der Keimzahl um 3-5 Zehnerpotenzen z.B. von 1.000.000 auf 10 Keime (5 Zehnerpotenzen). Entsprechend spricht man von Sterilisation erst, wenn keine Keime mehr nachweisbar sind. Dies wird bei einer Abreicherung um 6 Zehnerpotenzen als gegeben angenommen, also bei einer Reduktion von 1.000.000 auf 1. Je nach Vorgabe muss eine Desinfektion oder Sterilisation sichergestellt und validiert werden. In Inkubatoren wird trockene Hitze ohne Druck verwendet, dies unterscheidet sich von z.B. Autoklaven und daher sind auch andere Haltezeiten der Temperatur notwendig.

Zusätzliche Dekontaminationsmechanismen (Luft)

Mehrere Anbieter statten ihre Inkubatoren mittlerweile mit HEPA-Filter (high efficiency particulate air) zur Filtration von CO₂ und Luft aus. Obwohl durch die Türöffnung immer Keime in den Brutschrank gelangen, ist die Filtration der Gaszufuhr als risikominimierende Maßnahme positiv zu bewerten und damit eigentlich immer besser als keine Filtration. Allerdings müssen die Filter ausgetauscht werden, was Kontrolle erfordert und Geld kostet. In vielen Fällen muss jedoch bei Verwendung von Filtern ein Ventilator zur Verteilung genutzt werden. Dieser ist für uns aber ein wirkliches Kontaminationsrisiko. Daher würden wir diese Kombination ablehnen. Für ATMP und TEP sollte man Filter in Betracht ziehen, jedoch nur ohne Ventilator. In anderen Laboren geht es sowieso ohne.

Steckdosen im Innenraum oder Kabelkanäle

Wer darüber nachdenkt neue Assays wie Impedanzmessungen mit dem xCelligence oder Live Cell Imaging mit z.B. dem Juli zu machen oder einen Schüttler im Inkubator braucht, der sollte auch daran denken, dass Kabeldurchführungen am Inkubator die Dichtigkeit enorm erhöhen. Diese sind normalerweise in der Seitenwand integriert und lassen sich nicht nachträglich installieren. Für Inkubatoren von Binder können - gegen Aufpreis - Durchführungen nach Kundenwunsch platziert werden.

Vibrationen (z.B. durch Ventilatoren oder Pumpen)

Ventilatoren und Pumpen können zu störenden Vibrationen im Inkubator führen. Diese sind absolut kontraproduktiv für Koloniebildungs-Assays, Stammzell- und andere Sphäroid-Kulturen und können außerdem das Adhärieren der Zellen in Multiwellplatten beeinflussen. Aus diesem Grund ist - unserer Meinung nach - von Ventilatoren im Brutschrank abzuraten. Da die Vibration nicht in der Baumusterprüfung nach DIN Norm getestet wird, sollte man beim Vergleich der Hersteller in Bezug hierauf spezifisch nachfragen.

Zusätzlich haben wir die Erfahrung gemacht, dass Brutschränke mit Ventilatoren öfter im Bereich der Ventilator-Verschraubung innerhalb der Decke verkeimen können. Besonders Pilze können sich dort ansiedeln. Wenn sie vorhanden sind, werden die Sporen durch den Ventilator zusätzlich leichter verwirbelt. Daher sehen wir Ventilatoren generell kritisch.

Evtl. O₂-Regelung

Wer mit oxidativem Stress arbeitet, sollte sich schon jetzt überlegen, ob eine Sauerstoffregelung nicht sinnvoll ist. Die Hypoxie-Forschung folgt hier nämlich - wenn auch sehr langsam - dem Trend anzuerkennen, dass ein physiologischer Sauerstoffgehalt deutlich unter dem von Luft und damit den 21% im Inkubator liegt.

Qualifizierung und Validierung: Serviceleistungen

In GMP und GLP Laboren, also auch in solchen, die ATMP und TEP herstellen, müssen Geräte qualifiziert werden. D.h. bei einem Neukauf muss gemäß QbD (quality by design) ein Lasten- und Pflichtenheft erstellt werden und nach dem Kauf muss das Gerät im Labor am vorgesehenen Platz qualifiziert werden. Die Qualifizierung umfasst somit DQ, IQ, OQ und PQ (design qualification, installation qualification, operational qualification und performance qualification). Der ganze Prozess ist aufwendig und erfordert eine detaillierte Dokumentation. Er kann gemäß eines eigenen Validierungsplans durchgeführt werden, aber manchmal ist es sinnvoll und deutlich schneller, wenn man hierfür einen Service des Herstellers in Anspruch nimmt. Die Qualifizierungsdokumentation für einen Inkubator kann ca. die Dicke eines Leitzordners umfassen.

Hersteller und Modelle von Zellkultur-CO₂-Inkubatoren

Eine detaillierte Übersicht mit Herstellervergleich, Modellen, technischen Daten und unseren Bewertungen finden Sie auf der separaten Seite Zellkultur-CO₂-Inkubatoren – Hersteller, Vergleich und Modelle.

Direkt zu den auf der Detailseite dargestellten Herstellern:

• Eppendorf
• Binder
• BioAir / CellCare
• Memmert
• Weitere Hersteller von Zellkultur-Inkubatoren

Kaufkriterien Inkubatoren für Forschungslabore

Natürlich ist in allen Laboren der Preis immer ein wichtiges Kriterium. Trotzdem sollte man sich das Leben nicht unnötig schwer machen, nur um ein bisschen Geld zu sparen. Für uns gilt also folgende Wertigkeit im Forschungslabor:

• kein Ventilator außer er ist gut zu reinigen und verpilzt nicht (Kein Thermoinkubator!, Panasonic hat das Problem nicht.)
• geteilte Türen, gute Scharniere
• Wasserwanne
• möglichst wenig Gestänge im Innenraum, möglichst ausgezogener Innenraum
• Erholzeiten so kurz wie möglich (Temperatur, Feuchte, CO₂)
• schnelle CO₂ Erholung nach Türöffnung
• Preis
• Datenlogger ohne PC zur Kontrolle der Wachstumsbedingungen und Türöffnungen
• Hitzesterilisation

Kaufkriterien Inkubatoren für Pharma-QK Testlabore (Potency Assays, Freigabeassays)

Hier kommt es auf die Konstanz, Reproduzierbarkeit und Variabilität der Daten an. Außerdem arbeiten die meisten Testlabore nach einer ISO oder unter GMP/GLP. Daher haben wir hier folgende Präferenzreihenfolge für den Herstellervergleich:

• kein Ventilator außer er ist gut zu reinigen und verpilzt nicht (Kein Thermoinkubator!, Panasonic hat das Problem nicht.)
• geteilte Türen, gute Scharniere (wenn Türen häufig geöffnet werden)
• Wasserwanne oder Verdampfer
• Erholzeiten so kurz wie möglich (Temperatur, Feuchte, CO₂)
• Datenlogger möglichst mit Schnittstelle und Software zur Kontrolle der Wachstumsbedingungen und Türöffnungen
• möglichst wenig Gestänge im Innenraum, möglichst ausgezogener Innenraum
• Kabeldurchführungen
• eher zwei kleine als ein großer Inkubator um die Türöffnungen zu verringern
• schnelle CO₂ Erholung nach Türöffnung
• Preis
• Hitzesterilisation bei 180°C für 2 Stunden

Kaufkriterien Inkubatoren für ATMP und TEP Hersteller

ATMP und TEP sind Arzneimittel, d.h. sie unterliegen strengen Kontrollen und müssen qualitativ hochwertig sein. Außerdem müssen sie Vorgaben erfüllen und die technische Ausstattung zur Herstellung muss dem Stand der Technik entsprechen. Daher gibt es hier ein paar Punkte, die ein absolutes MUSS darstellen.

• kein Ventilator außer er ist gut zu reinigen und verpilzt nicht (Kein Thermoinkubator!, Panasonic hat das Problem nicht.)
• Eine Herstellung des Inkubators unter einem Qualitätsmanagementsystem nach ISO 13485 bzw. eine Medizinproduktezulassung kann ein zusätzliches Qualitätsmerkmal sein, ist für einen in der ATMP-Herstellung eingesetzten Inkubator jedoch keine generelle GMP-Anforderung. Entscheidend sind die dokumentierte Eignung für den vorgesehenen Zweck, die Qualifizierung und die risikobasierte Bewertung des Geräts
• Hitzesterilisation bei 180°C für 2 Stunden (Stand der Technik gefordert, SIP)
• keine Kupferoberfläche (Reinigbarkeit gefordert)
• möglichst wenig Gestänge im Innenraum, möglichst ausgezogener Innenraum (Reinigbarkeit gefordert)
• Erholzeiten so kurz wie möglich (Temperatur, Feuchte, CO₂)(gleichbleibende Qualität, Abweichungen vom Soll müssen begründet und bewertet werden)
• Datenlogger möglichst mit Schnittstelle und Software zur Kontrolle der Wachstumsbedingungen und Türöffnungen (Stand der Technik, ansonsten manuelle Kontrolle und Dokumentation mindestens täglich)
• DIN-konforme Steuerung und Nutzerverwaltung mit Code
• eher zwei kleine als ein großer Inkubator um die Türöffnungen zu verringern (Risiko-minimierende Maßnahme, Variabilität)
• Wasserwanne oder Verdampfer (letzteres wäre u.U. als sicherer anzusehen, muss bewertet werden, QbD)
• Ersatzflasche für CO₂