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Manuelle Zellzählung in der Zählkammer

Die Zählung von Zellen (eukaryotische und im Besonderen Säugerzellen) in der Zählkammer ist ein altes, aber immer noch gängiges Verfahren zur Bestimmung der Zellzahl pro ml. Hier wollen wir im Folgenden die wichtigsten Punkte der Zählung erläutern und Hinweise geben, wo man beim Trouble Shooting nach Fehlern suchen sollte.

Für die Zellzählung kann man verschiedene Kammern verwenden. Die Neubauer improved ist die gängigste Zählkammer in der Zellkultur. Aber andere Kammern wie die Thomakammer z.B. sind ebenfalls geeignet. Eine gute Übersicht über das Aussehen der Zählfelder findet man bei Optik Labor.

Die Zellzählung ist eine wichtige Grundlage für die Kontrolle des zellulären Wachstums über Wachstumskurven und natürlich ist das Ausplatieren der erste Schritt eines Assays. Eine präzise Zählung ist also eine wirklich wichtige Grundlage in der Zellkultur. Daher sind Zählungsmethoden und Zellzählgeräte (Counter) Thema in unserem Zellkultur Basiskurs und in den Fortbildungen Zellkultur Bioassays und QM in der Zellkultur.

Neubauerkammer classic und improved

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Quiz

Testen Sie sich selbst! Wie gut ist ihr Wissen zur Zählung in der Zählkammer ? Wenn Sie das Quiz beendet haben, bekommen Sie Ihre Punktzahl genannt. Über Review Quiz können Sie sich die richtigen Antworten anzeigen lassen. Hintergrund-Informationen finden Sie auf dieser Themenseite.

Zellzählung Formel ausrechnen Formblatt

 

Wer beim Berechnen von Zellzahlen Probleme hat oder seine Berechnung einfach überprüfen möchte, kann hier unser Excel Formblatt herunterladen. Tragen Sie einfach ihre Zahlen in die gelben Kästchen ein und lesen Sie das Ergebnis in den roten Feldern ab.

Inhaltsverzeichnis dieser Übersicht:

Verwendung von Trypanblau

Vorabhinweise Sterilität

Vorabhinweise Statistik

Anleitung Auszählverfahren

Kurz-Protokoll für eine optimale Zählung in der Neubauerkammer

Standardisierung von Zellzählungen in der Neubauerkammer

Benutzung von Zählkammern unter GMP

 

Hintergrund-Informationen

Verwendung von Trypanblau

Wer mit der Neubauerkammer zählt, sollte immer eine Trypanblau-Färbung mitmachen. Diese dauert nicht lange und ist nicht aufwendig, liefert jedoch wichtige Informationen zur Qualität der Zellen. Beide Ergebnisse (Zellzählung und Vitalität) sollten mindestens wöchentlich dokumentiert werden.

Für die Färbung werden die Zellen einfach ca. 1:2 bis 1:10 mit einer Trypanblau-Lösung versetzt. Tote Zellen werden von Trypanblau blau angefärbt, weil es durch die Membran gelangen kann. Lebendige Zellen werden nicht gefärbt. Dann werden die Zellen wie gewohnt ausgezählt. Allerdings sollte man gefärbte Proben nicht länger stehen lassen, da Trypanblau die Zellen langsam abtötet und somit falsch positive Ergebnisse produziert.

Vorabhinweise Sterilität

Die Entnahme der Probe für die Zählung muss unter der Sterilbank erfolgen. Das Beschicken der Kammer sollte jedoch vorzugsweise außerhalb der Sterilbank stattfinden, da die Kammer nicht steril ist und nach dem Anhauchen eine Kontaminationsquelle darstellt. Daher empfehlen wir eine Probe in ein steriles Eppi-Cap zu geben. Für Lebend-tot Zählungen ist dies sowieso notwendig.

Vorabhinweise Statistik

Die optimale Nutzung einer Neubauerkammer sieht eine Doppelbestimmung vor. D.h. es sollten beide Seiten der Zählkammer mit 2 unabhängigen Proben der Zellsuspension beschickt werden. Für Assays in denen Zellen gezählt werden oder wenn sehr kleine Zellzahlen ausgesät werden, sollte dies immer genauso durchgeführt werden. Für andere Anwendungen ist es allgemein akzeptiert eine Einfachbestimmung zu machen und nur eine Seite zu beschicken. Neubauerkammer Zählfelder
Beim Auszählen der Felder ist eigentlich vorgesehen auf beiden Seiten jeweils alle 4 großen Eckquadrate auszuzählen. Je weniger Felder man zählt, umso ungenauer wird die Zählung. Allerdings dauert es natürlich länger, alle Felder zu zählen. Als Daumenregel sollte man immer mindestens 150 Zellen zählen. Wenn man dafür mehrere Eckfelder zählen muss, sollte man es tun. Wenn man bereits in einem Eckquadrat 150 Zellen zählt, kann auch ein Eckquadrat reichen.

Für Zählungen unter GMP sollte man während der Validierung überprüfen, welche Anzahl an Feldern für eine ausreichend statistisch akzeptable Zählung notwendig sind.

Neubauerkammer Zählfelder

 

Anleitung Auszählverfahren

Für normale Säugerzellen nutzt man in der Zählkammer zum Auszählen die Eckquadrate. Für kleinere Zellen z.B. Erythrozyten, Hefen oder Algen zählt man Teile des Mittelquadrats aus, weil dieses noch feiner unterteilt ist und man häufig sehr hohe Zellzahlen pro ml hat.

Am besten zählt man im 10er Objektiv (100x absolute Vergrößerung), weil man dort ein ganzes Eckquadrat bzw. Mittelquadrat sehen kann. Das erleichtert die Orientierung.

 

Eckquadrat Neubauer improved Eckquadrat im Mikroskop (10x Objektiv)
Neubauerkammer Eckfeld Neubauerkammer Eckquadrat im Mikroskop  

 

In den vielen kammern ist das Mittelquadrat zur Zählung von besonders kleinen Zellen wie z.B. Blutzellen noch weiter unterteilt und die Hilfslinien, die in den Eckquadraten nur außen vorkommen sind hier für alle Gruppenquadrate vorhanden. Dies erlaubt bei hohen Zellzahlen nur Teile der 16 oder 25 Gruppenquadrate auszuzählen (nummerrierte Felder in den Bildern unten). Für Säugerzellen werden die Mittelquadrate meist nicht genutzt, weil die Zellen größer sind und die zusätzlichen Linien dann nur verwirren.

Mittelquadrat Neubauer improved Mittelquadrat Neubauer classic
Neubauerkammer improved Mittelquadrat Neubauerkammer classic Mittelquadrat

Die Seiten jedes Eckquadrats sowie des Mittelquadrats sind jeweils 1mm lang. Daher ist die Fläche eines jeden Eckquadrats sowie des Mittelquadrates jeweils 1mm2. Durch das Auflegen des Deckglases entsteht ein dreidimensionaler Raum definierter Größe. Bei fast allen Kammern ist die Höhe dieses Raumes = Kammertiefe = 0,1mm. Die Kammertiefe ist auf der Kammer angegeben. Das auszuzählende Volumen ist somit im Eckquadrat und Mittelquadrat jeweils 0,1mm3 = 0,1µl. Durch Multiplikation der Zellzahl pro Eck- oder Mittelquadrat mit 104 (= 10.000) ergibt sich die Zellzahl pro ml da 104 * 0,1µL = 1ml.

Die zweite Zahl, die auf der Kammer angegeben ist, nennt die Fläche eines µ-Quadrates (s.o., meist 0,0025mm2) im Mittelquadrat. Diese Angabe wird gemacht, weil man mit dieser Angabe durch Multiplikation alle Flächen berechnen kann. Also wenn man alle µ-Quadrate im Mittelquadrat auszählt, ergibt das: Mittelquadrat = 25 Gruppenquadrate à 16 µ-Quadraten à 0,0025mm2 = 25 * 16 * 0,0025mm2 = 1mm2.

 

Die Eckquadrate unterschiedlicher Kammern sind unterschiedlich begrenzt. Manche Kammern haben eine, andere zwei, die neueren Kammern drei äußere Begrenzungslinien. In allen Fällen ist eine dieser Linien die eigentlich ausschlaggebende, während die anderen Hilfslinien sind. In der Abb. sind die entscheidenden Linien rot markiert, während die Hilfslinien grün sind.

In allen Fällen werden die Eckquadrate so ausgezählt, dass an zwei Seiten (in der Abb. oben und rechts) die Zellen mitgezählt werden, die die Begrenzungslinie berühren (schwarze Zellen) und an zwei Seiten (in der Abb. unten und links) die Zellen, die die Begrenzungslinie berühren, nicht mitgezählt werden.

Anleitung Zählung

 

Kurz-Protokoll für eine optimale Zählung in der Neubauerkammer

Vorbereitungen

Suspensionszellen können direkt aus der Kulturflasche entnommen werden. Adhärente Zellen werden vorab abgelöst mittels Trypsin oder anderen Detachment-Lösungen, die Reaktion wird gegebenenfalls gestoppt und dann in allen Fällen zentrifugiert und das Pellet resuspendiert.

Materialien

  • Handschuhe
  • zu zählende Zellsuspension in Flasche oder Zentrifungenröhrchen
  • gegebenenfalls Ständer für Zentrifungenröhrchen (s.o.)
  • sterile "gelbe" 20-200ml Spitzen unter der Bank
  • gute mit Ethanol gereinigte Zellkultur Eppendorf-Pipette 20-200µL unter der Bank
  • sterile Reaktionsgefäße (Eppi-Caps z.B.: 1,5ml)
  • Ständer für Eppis
  • Müllbeutel für Trypanblau-Abfall
  • Trypanblaulösung (nicht zu alt oder frisch zentrifugiert)
  • Neubauer Zählkammer und zugehöriges Deckglas, beide gereinigt
  • Mikroskop und Phasenkontrast 10x Objektiv (bei Hefen, Algen und Erys 40x)
  • Zähluhr
  • Laborbuch oder Formblatt Zellzählung

Materialien Zellzählung

 

Durchführung

In der Sterilbank

  • Zellsuspension gut mischen
  • 50µL Probe der Zellsuspension mit einer Eppendorf-Pipette (z.B. 20-200µl) entnehmen
  • Probe in eine steriles Eppi-Cap überführen
  • zweites Mal 50µL Probe der Zellsuspension mit einer Eppendorf-Pipette (z.B. 20-200µl) entnehmen
  • Probe in eine zweites steriles Eppi-Cap überführen

Außerhalb der Sterilbank

  • zur ersten Probe 50µL Trypanblau pipettieren und mischen (= Verdünnung 1:2)
  • neue Spitze aufsetzen
  • zur zweiten Probe ebenfalls 50µL Trypanblau pipettieren und mischen (= Verdünnung 1:2)
  • Neubauerkammer anhauchen
  • Deckglas aufsetzen und Newton'sche Ringe prüfen
  • neue Spitze aufsetzen
  • Probe 1 in Kammer 1 = oben pipettieren
  • neue Spitze aufsetzen
  • Probe 2 in Kammer 2 = unten pipettieren
  • Kammer 3sec setzen lassen
  • prüfen, ob das Deckglas noch fest sitzt
  • Kammer unter das Mikroskop legen
  • 10x PH Objektiv verwenden (Invers- oder Auflicht-Mikroskop)
  • oberes Zählfeld suchen ohne die Kammer mit dem Objektiv zu berühren
  • im 10x Objektiv kann man ein komplettes Eckquadrat sehen
  • links oben anfangen und alle 4 Eckfelder zählen
  • jeweils die Einzelwerte aufschreiben (Laborbuch)
  • unteres Zählfeld suchen
  • links oben anfangen und alle 4 Eckfelder zählen
  • jeweils die Einzelwerte aufschreiben (Laborbuch)
  • Werte auf Homogenität überprüfen
  • Mittelwert aus allen 8 Werten der Eckfelder bilden
    z.B. (51+54+50+52+53+51+53+52)/8=52
  • Zellzahl berechnen:
    Zellzahl/ml = Mittelwert (52) * Verdünnungsfaktor (hier 2) *104 Zellen/ml
    = 104 * 104 Zellen/ml = 1.040.000 Zellen/ml =  1,04 Mio Zellen pro ml

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Zellzählung Formel ausrechnen Formblatt

 

Wer beim Berechnen von Zellzahlen Probleme hat oder seine Berechnung einfach überprüfen möchte, kann hier unser Excel Formblatt herunterladen. Tragen Sie einfach ihre Zahlen in die gelben Kästchen ein und lesen Sie das Ergebnis in den roten Feldern ab.

Standardisierung von Zellzählungen in der Neubauerkammer

Wer eine Zählung mittels Neubauerkammer standardisieren möchte, sollte folgende Teilschritte mit einbeziehen, prüfen und in einer SOP festlegen. Die SOP sollte unbedingt ein Bild der Quadrataufteilung beinhalten, da hier die meisten Missverständnisse entstehen:

  • Resuspendieren und mischen der Zellsuspension
  • Verdünnung der Zellsuspension (am besten μl + μl)
  • Dauer bis zur Probennahme
  • Pipette und Tips (Systeme eines Herstellers sind präziser als no.name Spitzen)
  • Korrekter Sitz des Deckglases vor und nach dem Probenauftrag
  • Menge der ausgezähten Quadrate. Für präzise Zählungen beide Seiten der Zählkammer mit der gleichen Probe beschicken (=Doppelbestimmung) und jeweils 4 große Eckquadrate auszählen. Für Stammkulturen reicht u.U. eine Seite und je nach Verdünnung der Zellsuspension evtl. weniger als 4 Quadrate. 
  • genaue Festlegung des Zählmodus. Vor allem bei Kammern mit drei Begrenzungslinien.
  • genaue Erläuterung der Berechnungsformeln. Was setzt man ein, wenn man 1 oder mehrere Quadrate gezählt hat, wie setzt man Verdünnungsfaktoren ein und vor allem wo.

 

Benutzung von Zählkammern unter GMP

Unter GMP sollten sich alle Techniken am Stand der Technik orientieren. Dies ist eigentlich mittlerweile im Bezug auf die Zellzählung die automatisierte Zählung mittels eines Counters. Trotzdem ist es momentan möglich auch unter GMP mit Hematozytometern zu zählen. Dann jedoch muss eine Validierung der Methode erfolgen. Im Besondern sollte die Abweichung bei Zählungen verschiedener Personen berücksichtigt werden.