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Mykoplasmen-Kontaminationen in der Zellkultur

Mykoplasmen sind zusammen mit Kreuz-Kontaminationen die beiden schlimmsten Probleme, die wir in der Zellkultur haben. Darüberhinaus sind Mykoplasmen aber wahrscheinlich die hinterhältigsten mikrobiologischen Zellkultur-Kontaminationen, die wir kennen!

Warum ?

  • Weil man sie im Lichtmikroskop nicht sehen kann,
  • weil die Zellen nicht so schnell "umbringen" wie andere Bakterien,
  • weil sie in vielen Zelllinien schon Jahrzehnte vorhanden sind und
  • weil sie jeden Tag mit uns ins Zellkulturlabor gelangen.

Das schlimmste an Mykoplasmen ist jedoch, dass sie es schaffen, Zellkultivierer davon zu überzeugen, dass nur andere sie haben und sie sie anhaltend ignorieren. Anfragen bei Zellkultur-Nutzern durch verschiedene Zellbanken ergaben, dass momentan nur ca. 30% der Zellkulturlabore auf Mykoplasmen testen und die wenigsten testen regelmäßig. Daher ist es allerdings nicht erstaunlich, dass die Kontaminationsraten je nach Labor zwischen 4 und 90% liegen.

Dass das keine gute Idee ist, wollen wir hier gerne deutlich machen, indem wir beschreiben, was Mycoplasmen sind und wie man sie erkennen kann.

Zellkultur mit Mycoplasmen-Kontamination

Die folgenden Themen finden Sie auf dieser Seite:

Mykoplasmen-Einordnung

Auswirkungen auf Zellkulturen

Verbreitung von Mykoplasmen

Ursprung von Mykoplasmen-Kontaminationen

Mykoplasmen-Nachweis-Methoden

Mykoplasmen-Nachweis Kits

Anforderungen der EuPharm

Zellkultur-Mykoplasmenspezies

 

Mykoplasmen-Einordnung

Mykoplasmen sind Bakterien und gehören zur Klasse der Mollicutes (Weichhäuter), weil sie natürlicherweise keine Zellwand ausbilden. Früher nannte man sie auch PPLO (pleuropneumonia-like organisms), dieser Begriff wird heute jedoch nur noch selten verwendet.

Da Mykoplasmen keine Zellwand ausbilden, sind sie vollkommen resistent gegen die Antibiotika, die wir normalerweise in der Zellkultur einsetzen, also z.B. Penicillin, Streptomycin, Gentamycin etc.

Außerdem bewirkt die fehlende Zellwand, dass Mycoplasmen 0,2µm Membranfilter passieren können. Der aufgebrachte Druck drückt die sich verformenden Mykoplasmen durch die Poren, auch wenn sie eigentlich größer als 0,2 µm sind!

Mycoplasmenund Bakterien Vergleich

Auswirkungen auf Zellkulturen

Mykoplasmen sind Parasiten! D.h. sie nehmen zum einen Nährstoffe aus dem Zellkulturmedium auf, aber sie entziehen den Zellen auch weitere Stoffe, die sie nicht selbst herstellen können. Darüber hinaus produzieren sie jedoch auch noch Toxine, die die Zellen  zusätzlich schädigen. Hier eine Liste der nachgewiesenen Effekte.

  • Hemmung der Zellproliferation durch Nährstoffentzug
  • Abfall des pH-Werts im Medium durch schnellen Glucose-Abbau
  • Arginin-Verarmung und dadurch Hemmung der Protein-Biosynthese
  • Hemmung der Differenzierung
  • Aktivierung von Immunzellen (Lymphocyten)
  • Veränderung der Membraneigenschaften
  • Veränderung des Protein-Expressionsprofils
  • Einzelne Spezies können die Zellen penetrieren
  • Können Chromosomen-Abberationen verursachen
  • Verringern die Virenproduktion in Produktionslinien

 

Verbreitung von Mykoplasmen-Kontaminationen in Zellkulturen

Die internationalen Zellbanken, allen voran die DSMZ, testen regelmäßig die Zelllinien, die ihnen zugeschickt werden und publizieren die Ergebnisse. Hier einige der Ergebnisse in Kurzform.

  • Im Test durch Zellbanken werden im Durchnitt 15-35% kontaminierte Kulturen ermittelt
  • Manche Studien zeigen sogar eine Rate von bis zu 80%
  • In industriellen Produktions-Kulturen kommen weniger Mycoplasmen vor als in Forschungskulturen
  • Wer nicht testet hat meist Mycoplasmen und dann auch in vielen Kulturen, wer testet hat meist keine (mehr)
  • Nur 30-50% der Forschungs-Labore testen auf Mycoplasmen
  • Nur < 20% der Forschungs-Labore testen regelmäßig

 

Ursprung von Mykoplasmen-Kontaminationen

Mykoplasmen-Kontaminationen fallen generell in 2 Kategorien: a) direkte und b) indirekte Kontamination. Unter direkten Kontaminationen versteht man, dass kontaminierte Lösungen zu den Zellen gegeben werden (z.B. FCS, Wachstumsfaktoren, Coating-Proteine). Indirekte Kontaminationen kommen meist durch Fehler in der sterilen Arbeitstechnik oder durch mangelnde Qualitätskontrolle zu Stande.

  • Durch mangelnde Hygiene werden menschliche Mycoplasmen auf Handschuhe oder Pipetten übertragen und gelangen von dort durch weitere Fehler in die Kultur
  • Mycoplasmen werden beim gleichzeitigen bearbeiten von einer Kultur auf eine andere übertragen
  • Mycoplasmen überleben in Medientröpfchen ca. 6 Wochen bei RT
  • Mycoplasmen können im Stickstofftank von einem Kryoröhrchen auf andere übertragen werden

 

Mykoplasmen-Nachweis-Methoden

Unter den Nachweis-Methoden für Mykoplasmen gibt es zwei besonders empfehlenswerte. Zum einen ein schneller und einfacher Nachweis mit DAPI oder Hoechst-Farbstoffen und zum zweiten der sensitive und günstige Nachweis über PCR. Hier sind zwei Beispiele dargestellt, wie man z.B. eine neue Charge von FCS testen kann.

Im ersten Beispiel wird das zu testende Reagenz (hier z.B. eine neue FCS Charge) zu einer sauberen Zellkultur gegeben und diese 7 Tage damit kultiviert (länger ist natürlich sicherer). Danach wird mit einem kommerziellen Kit der Zellkultur-Überstand mittels PCR getestet.

Zellkultur Mycoplasmen-Nachweis PCR

Im zweiten Beispiel geht man identisch vor, allerdings fixiert man die Zellen am Ende und färbt sie mit DAPI oder Hoechst. Nun kann man eventuelle Mykoplasmen-Kontaminationen im Fluoreszenz-Mikroskop erkennen. Dieser Nachweis ist allerdings deutlich weniger sensitiv als die PCR. Wer diese Methode als einzige nutzen möchte, sollte immer eine Inkubationszeit von mindestens 14-21 Tagen einhalten.

 

Zellkultur Mycoplasmen-Nachweis DAPI

 

Mykoplasmen-Nachweis-Kits

Firma Bemerkungen: Research kits
PromoKine

PromoKine

Methode: PCR und Gel; Nachweisgrenze: <1000-2500 KBE; GMP: nein

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieser Kit stellt eine methodische Vereinfachung dar. Die Tubes enthalten bereits Nukleotide, der MasterMix ist fertig und enthält auch schon Ladepuffer. Damit entfallen viele Pipettierschritte. Außerdem ist die Positivkontrolle in eigenen Tubes vorgelegt, sodass seltener Kontaminationen vorkommen. 3 Pipettierschritte insg.
Test kit IC

Mycoplasma Test-Kit IC Mycoplasma Test-Kit IC

In unserem MOOC haben wir dieses Kit benutzt, um in einem Video zu demonstrieren wie eine PCR funktioniert.

Ergebnis Beispiele:

Mykoplasmen PCR Gel Mycoplasmen PCR Gel

Legende PCR gel links:
Detection of mycoplasmas with PCR Mycoplasma Test Kit I/C. Left to right: 100 bp DNA ladder; Positive control; 10; 100; 1,000; 10,000; 100,000; 1000,000 mycoplasmas/sample volume. Internal control DNA: 479 bp band; Positive sample/control: 270 bp band.

Legende PCR gel rechts:
Detection of mycoplasmas with PCR Mycoplasma Test Kit I/C (image kindly provided by a customer). Left to right: DNA ladder; Test Samples (lanes 1-12);  Internal/Negative Control (lane 13); Positive Control (lane 14).

Nachweisbare Mykoplasmen-Arten:

28 (ja/nein Ergebnis) =

  • M. orale, M. arginini, M. hyorhinis, A. laidlawii, M. fermentans, M. pneumoniae, M. synoviae (EuPharm 7 von 7-9)
  • M. hominis, M. penetrans, M. pirum, U. urealyticum, M. pulmonis, M. falconis, M. arthritidis, M. spermatophilum, M. opalescens, M. primatum, M. maculosum, M. bovis, M. cloacale, M. hyosynoviae, M. salivarium, M. faucium, M. genitalium, M. bovigenitalium, M. sp. ovine/caprine, M. agalactica, M. timone
Preis pro Test: ca. 6,63 Euro

 

Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen: Research kits
Minerva

PCR-Gel

<1000-2500 KBE

GMP: -

28 (ja/nein) = 
  • M. orale, M. arginini, M. hyorhinis, A. laidlawii, M. fermentans, M. pneumoniae, M. synoviae, (EuPharm 7 von 7-9)
  • M. hominis, M. penetrans, M. pirum, U. urealyticum, M. pulmonis, M. falconis, M. arthritidis, M. spermatophilum, M. opalescens, M. primatum, M. maculosum, M. bovis, M. cloacale, M. hyosynoviae, M. salivarium, M. faucium, M. genitalium, M. bovigenitalium, M. sp. ovine/caprine, M. agalactica, M. timone,
<10,34 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieser Kit stellt eine methodische Vereinfachung dar. Die Tubes enthalten bereits Nukleotide, der MasterMix ist fertig und enthält auch schon Ladepuffer. Damit entfallen viele Pipettierschritte. Außerdem ist die Positivkontrolle in eigenen Tubes vorgelegt, sodass seltener Kontaminationen vorkommen. 4 Pipettierschritte insg. 
VenorGeM Advance
Sigma

PCR-Gel

<1000-2500 KBE

GMP: -

19 (ja/nein) = 
  • M. arginini, A. laidlawii, M. orale, M. fermentans, M. hyorhinis, (EuPharm 5 von 7-9)
  • M. salivarium, M. hominis, M. agalactiae, M. arthritidis, M. bovis, M. cloacale, M. falconis, M. faucium, M. hyosynoviae, M. opalescens, M. primatum, M. pulmonis, M. spermatophilum, M. timone
<9,96 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieser Kit stellt eine methodische Vereinfachung dar. Die Tubes enthalten bereits Nukleotide, der MasterMix ist fertig und enthält auch schon Ladepuffer. Damit entfallen viele Pipettierschritte. Außerdem ist die Positivkontrolle in eigenen Tubes vorgelegt, sodass seltener Kontaminationen vorkommen. 3 Pipettierschritte insg. 
LookOut®
Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen:keine interne Kontrolle
PromoKine

PCR-Gel

~ 10-1000 KBE

GMP: -

  < 7,45

 

PromoKine

 

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

Dieser Kit enthält KEINE interne Kontrolle. Daher besteht die Gefahr von falsch-negativen Ergebnissen. Ansonsten ist er aber sehr gut zu handhaben und funktioniert verlässlich. Hier ist zur methodischen Vereinfachung ein MasterMix enthalten der sogar bereits die Polymerase enthält. Allerdings muss man die Positivkontrolle pipettieren. 3 Pipettierschritte insg. 
Test Kit II

R&D Systems

Hybridization- ELISA

~15 - 2500 KBE

GMP: -

8 (ja/nein) = 
  • A. laidlawiiM. orale, M. arginini, M. hyorhinis, M. fermentans (EuPharm 5 von 7-9)
  • M. hominis
  • M. pirum
  • M. salivarium
 ~4 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

In diesem Assay wird rRNA von Mycoplasmen über einen ELISA colorimetrisch nachgewiesen. Der Assay kreuzreagiert mit Lactobacillus und ist damit nicht mycoplasmen-spezifisch.  
MycoProbe®
Agilent

PCR-Gel

n.a.

GMP: -

die meisten (ja/nein) ~9,8 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

Dieser Kit enthält nur Primer. Polymerase und Reaktionspuffer sind nicht enthalten. Über einen Restiktionsverdau können 5 Spezies identifiziert werden. Es wird nicht angegeben, welche Mycoplasmen genau mit "die meisten" gemeint ist. Die interne Kontrolle ist nur eine DNA und somit eine PCR-Kontrolle.
Mycoplasma Plus Primer set
Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen: Pharma-Kits
Greiner BioOne

PCR- Mikroarray

<10 KBE

GMP: +

alle (ja/nein), (EuPharm 9 von 7-9)
40 (identifiziert)
>560

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja
Pharma-Kit
 geeignet zur Freigabeprüfung. Hat alle Kontrollen und identifiziert 40 Mycoplasmen aus Artniveau zur schnellen Identifikation der Kontaminationsquelle. Darüber hinaus ist eine Universalsonde vorhanden, die alle anderen Mycoplasmenspezies detektiert, die bisher bekannt sind. Aber es sind spezielle Geräte notwendig, die gekauft werden müssen. Das System wirdbereits in der Pharmaindustrie eingesetzt.
CytoinspectTM

Roche

PCR-Gel

<10 KBE

GMP: +

alle (ja/nein), (EuPharm ? von 7-9) >500

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieses Pharma-Kit nutzt eine Universalsonde und wirft damit am Ende nur ein Ja/Nein Ergebnis aus. Dafür sind allerdings nur gängige Geräte notwendig, die jedoch ebenfalls qualifiziert werden müssen. Das Kit wurde von Genentech entwickelt und wird bei Roche auch schon mit EMEA approval für Pharmaprüfungen verwendet.
MycoTool

* Price is price/sample when purchasing a normal size kit including all reagents.

 

Anforderungen der EuPharm.:

Folgende Stämme werden für die Validierung eines Mykplasmen-Nachweises gemäß Pharmacopoiea als Kontrollstämme gefordert. Die Nachweisgrenzen, die man erreichen muss, liegen je nach Test bei 10-100 KBE pro ml. Je nach Produkt wird ein (vorgegebener) Stamm auch als Positivkontrolle mitgetestet:

  • A. laidlawii
  • M. fermentans
  • M. hyorhinis (where cell-culture enrichment is used, a fastidious strain such as ATCC 29052 is included)
  • M. orale
  • M. pneumoniae or M. gallisepticum
  • M. synoviae (where there is use of or exposure to avian material during production)
  • Mycoplasma arginini
  • Spiroplasma citri (where there is use of or exposure to insect or plant material during production)

 

Die wichtigsten Zellkultur-Mykoplasmen sind

  • M. orale
  • M. hyorhinis
  • M. arginini
  • M. fermentans
  • M. salivarium
  • M. hominis