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Vergleich Mykoplasmen Test-Kits für die Zellkultur (Forschung und GMP)

Wenn sie einen Mykoplasmen-Test kaufen wollen, können sie unsere Übersicht und einen Vergleich der verschiedenen Anbieter von Mykoplasmentests und Kits als Entscheidungshilfe nutzen. Ein solcher hersteller-Vergleich ist äußerst empfehlenswert, da sich Preise und Nachweisgrenzen sowie Detektions-Spektren deutlich unterscheiden. Außerdem haben wir eine kurze Darstellung des Testprinzips für einen PCR Nachweis und eine DAPI Färbung als Erläuterung dargestellt. Schauen Sie genau nach, was die Kits können und was nicht, bevor sie ein Kit kaufen!

 

Die folgenden Themen finden Sie auf dieser Seite:

Mykoplasmen-Nachweis-Methoden

Mykoplasmen-Nachweis Kits

Anforderungen der EuPharm

Zellkultur-Mykoplasmenspezies

 

Zellkultur mit Mycoplasmen-Kontamination

Mykoplasmen-Nachweis-Methoden und Kits kaufen

Unter den Nachweis-Methoden für Mykoplasmen gibt es zwei besonders empfehlenswerte Mykoplasmentest oder Kit-Arten. Zum einen ein schneller und einfacher Mykoplasmentest mit DAPI oder Hoechst-Farbstoffen und zum zweiten der sensitive und günstige Mykoplasmen-Nachweis über PCR Kits. Im Folgenden sind zwei Beispiele dargestellt, wie man z.B. eine neue Charge von FCS testen kann.

PCR Test-Kits für Mykoplasmen

Im ersten Beispiel wird das zu testende Reagenz (hier z.B. eine neue FCS Charge) zu einer sauberen Zellkultur gegeben und diese 7 Tage damit kultiviert (länger ist natürlich sicherer). Danach wird mit einem kommerziellen Mycoplasmen-Kit der Zellkultur-Überstand mittels PCR getestet und im Gel ausgewertet.

Zellkultur Mycoplasmen-Nachweis PCR

Video zum Mykoplasmentest aus unserem MOOC

In diesem Video zeigen zwei Studenten wie man den Mykoplasmen-Kit IC von PromoKine benutzt. Das Video ist in englischer Sprache, sollte aber gut zu verstehen sein, auch wenn man nicht so gut Englisch spricht. Das Video stammt aus unserem DNA MOOC.

See how a mycoplasma PCR is performed in the lab using a PromoKine Mycoplasma kit. Besides that, encounter Can, Andrei and Ulla who are BCCB 3rd year students at Jacobs University, Bremen and have a laugh with them. The video is a little longer than 20min, but as it is part of our DNA MOOC is shows all steps and explains all components of the kit.  start video...

Further videos from the MOOC: DNA - from structure to therapy are on our MOOC page.

Mycoplasma PCR Kit PromoKine Video

 

Mykoplasmen-Test mittels DAPI Färbung

Im zweiten Beispiel geht man anfangs identisch vor, allerdings fixiert man die Zellen am Ende und färbt sie mit DAPI oder Hoechst. Nun kann man eventuelle Mykoplasmen-Kontaminationen im Fluoreszenz-Mikroskop erkennen. Dieser Mykoplasmen-Nachweis ist allerdings deutlich weniger sensitiv als die PCR Methode. Wer diese Methode als einzige nutzen möchte, sollte immer eine Inkubationszeit von mindestens 14-21 Tagen einhalten.

 

Zellkultur Mycoplasmen-Nachweis DAPI

 

Mykoplasmen-Nachweis-Kits

Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen: Research kits
PromoKine

PCR-Gel Kit

<1000-2500 KBE/mL

GMP: -

28 (ja/nein) = Detektion von
  • M. orale, M. arginini, M. hyorhinis, A. laidlawii, M. fermentans, M. pneumoniae, M. synoviae, (EuPharm 7 von 7-9)
  • M. hominis, M. penetrans, M. pirum, U. urealyticum, M. pulmonis, M. falconis, M. arthritidis, M. spermatophilum, M. opalescens, M. primatum, M. maculosum, M. bovis, M. cloacale, M. hyosynoviae, M. salivarium, M. faucium, M. genitalium, M. bovigenitalium, M. sp. ovine/caprine, M. agalactica, M. timone,
<6,63

PromoKine

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieser Kit stellt eine methodische Vereinfachung dar. Die Tubes enthalten bereits Nukleotide, der MasterMix ist fertig und enthält auch schon Ladepuffer. Damit entfallen viele Pipettierschritte. Außerdem ist die Positivkontrolle in eigenen Tubes vorgelegt, sodass seltener Kontaminationen vorkommen. 4 Pipettierschritte insg.
Test kit IC

Mycoplasma Test-Kit IC

Mycoplasma Test-Kit IC

In unserem MOOC haben wir dieses Kit benutzt, um in einem Video zu demonstrieren wie eine PCR funktioniert.

Minerva

PCR-Gel Kit

<1000-2500 KBE/mL

GMP: -

28 (ja/nein) = Detektion von
  • M. orale, M. arginini, M. hyorhinis, A. laidlawii, M. fermentans, M. pneumoniae, M. synoviae, (EuPharm 7 von 7-9)
  • M. hominis, M. penetrans, M. pirum, U. urealyticum, M. pulmonis, M. falconis, M. arthritidis, M. spermatophilum, M. opalescens, M. primatum, M. maculosum, M. bovis, M. cloacale, M. hyosynoviae, M. salivarium, M. faucium, M. genitalium, M. bovigenitalium, M. sp. ovine/caprine, M. agalactica, M. timone,
<10,34 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieser Kit stellt eine methodische Vereinfachung dar. Die Tubes enthalten bereits Nukleotide, der MasterMix ist fertig und enthält auch schon Ladepuffer. Damit entfallen viele Pipettierschritte. Außerdem ist die Positivkontrolle in eigenen Tubes vorgelegt, sodass seltener Kontaminationen vorkommen. 4 Pipettierschritte insg. 
VenorGeM Advance
Sigma

PCR-Gel Kit

<1000-2500 KBE/mL

GMP: -

19 (ja/nein) = Detektion von
  • M. arginini, A. laidlawii, M. orale, M. fermentans, M. hyorhinis, (EuPharm 5 von 7-9)
  • M. salivarium, M. hominis, M. agalactiae, M. arthritidis, M. bovis, M. cloacale, M. falconis, M. faucium, M. hyosynoviae, M. opalescens, M. primatum, M. pulmonis, M. spermatophilum, M. timone
<9,96 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieser Kit stellt eine methodische Vereinfachung dar. Die Tubes enthalten bereits Nukleotide, der MasterMix ist fertig und enthält auch schon Ladepuffer. Damit entfallen viele Pipettierschritte. Außerdem ist die Positivkontrolle in eigenen Tubes vorgelegt, sodass seltener Kontaminationen vorkommen. 4 Pipettierschritte insg. 
LookOut®
Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen:keine interne Kontrolle
PromoKine

PCR-Gel Kit

~ 10-1000 KBE/mL

GMP: -

  < 7,45

 

PromoKine

 

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

Dieser Kit enthält KEINE interne Kontrolle. Daher besteht die Gefahr von falsch-negativen Ergebnissen. Ansonsten ist er aber sehr gut zu handhaben und funktioniert verlässlich. Hier ist zur methodischen Vereinfachung ein MasterMix enthalten der sogar bereits die Polymerase enthält. Allerdings muss man die Positivkontrolle pipettieren. 3 Pipettierschritte insg. 
Test Kit II

R&D Systems

Hybridization- ELISA Kit

~15 - 2500 KBE/mL

GMP: -

8 (ja/nein) = Detektion von
  • A. laidlawiiM. orale, M. arginini, M. hyorhinis, M. fermentans (EuPharm 5 von 7-9)
  • M. hominis
  • M. pirum
  • M. salivarium
 ~4 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

In diesem Assay wird rRNA von Mycoplasmen über einen ELISA colorimetrisch nachgewiesen. Der Assay kreuzreagiert mit Lactobacillus und ist damit nicht mycoplasmen-spezifisch. Dauert ca. 4,5 Stunden, mehrere Waschschritte. Kann Überstände und Zelllysate analysieren.
MycoProbe®
Agilent

PCR-Gel Kit

n.a.

GMP: -

die meisten (ja/nein) ~9,8 Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

Dieser Kit enthält nur Primer. Polymerase und Reaktionspuffer sind nicht enthalten. Über einen Restiktionsverdau können 5 Spezies identifiziert werden. Es wird nicht angegeben, welche Mycoplasmen genau mit "die meisten" gemeint ist. Die interne Kontrolle ist nur eine DNA und somit eine PCR-Kontrolle.
Mycoplasma Plus Primer set
Invivogen

Zellkultur Assay mit Indikatorzellen Kit

500-50.000 KBE/mL

GMP: -

Detektiert alle Zellkultur Mycoplasma und Acholeplasma Spezies (ohne Angabe welche genau). Kreuzregiert mit manchen Bakterien. ~ 2

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

PlasmoTest™ features two major constituents: the Mycoplasma sensor cells and the HEK-Blue™ Detection medium.
The Mycoplasma sensor cells detect the presence of mycoplasmas leading to a color change of the HEK-Blue™ Detection medium. The Mycoplasma sensor cells recognize mycoplasmas through Toll-like Receptor 2 (TLR2), a pathogen recognition receptor. In the presence of mycoplasmas, TLR2 initiates a signaling cascade leading to the activation of NF-kB and other transcription factors. These transcription factors induce the secretion of SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatase) in the supernatant which is readily detected by the purple/blue coloration of the HEK-Blue™ Detection medium.

PlasmoTest™

BioTool /

Bimake

Farbtest of Metaboliten Kit

10.000/mL

GMP: -

Keine Angabe zu detektierten Arten. Geht nicht mir serumfreien Medien und allen F12-basierten Medien. ~ 1,5

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: nein

Durchführung dauert ca. 1h. Auswertung rein optisch, also ohne Reader ohne mit dem zweiten Kit über einen ELISA Reader.

Mycoplasma Detection Kit-QuickTest

Mycoplasma Detection Kit – DigitalTest v2.0

Molecular Probes

Fluoreszenzmikroskopie Kit

NWG keine Angabe, ca. 10^6-8 KBE/mL

GMP: ?

Keine Angabe zu detektierten Arten, wahrscheinlich breites Spetrum, aber mit Kreuzreaktionen. ~3,5

Positivkontrolle: ja, aber Partikel
Interne Kontrolle: nein

Durchführung dauert ca. 30min bis 1h je nach Anzahl an Proben. Aufwendiges Handling von Deckgläsern und Fixativ.

Firma Methode/NWG/GMP Spezies Preis Bemerkungen: Pharma-Kits
Greiner BioOne

PCR- Mikroarray Kit

<10 KBE

GMP: +

alle (ja/nein), (EuPharm 9 von 7-9)
40 (identifiziert)
>560

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja
Pharma-Kit
 geeignet zur Freigabeprüfung. Hat alle Kontrollen und identifiziert 40 Mycoplasmen aus Artniveau zur schnellen Identifikation der Kontaminationsquelle. Darüber hinaus ist eine Universalsonde vorhanden, die alle anderen Mycoplasmenspezies detektiert, die bisher bekannt sind. Aber es sind spezielle Geräte notwednig, die gekauft werden müssen. Das System wird bereits in der Pharmaindustrie eingesetzt.
CytoinspectTM

Roche

PCR-Gel Kit

<10 KBE

GMP: +

alle (ja/nein), (EuPharm ? von 7-9) >500

Positivkontrolle: ja
Interne Kontrolle: ja

Dieses Pharma-Kit nutzt eine Universalsonde und wirft damit am Ende nur ein Ja/Nein Ergebnis aus. Dafür sind allerdings nur gängige Geräte notwendig, die jedoch ebenfalls qualifiziert werden müssen. Das Kit wurde von Genentech entwickelt und wird bei Roche auch schon mit EMEA approval für Pharmaprüfungen verwendet.
MycoTool

 

Anforderungen der EuPharm. für GMP:

Folgende Stämme werden für die Validierung eines Mykplasmen-Nachweises gemäß Pharmacopoiea als Kontrollstämme gefordert. Die Nachweisgrenzen, die man erreichen muss, liegen je nach Test bei 10-100 KBE pro ml. Je nach Produkt wird ein (vorgegebener) Stamm auch als Positivkontrolle mitgetestet:

  • A. laidlawii
  • Mycoplasma fermentans
  • Mycoplasma hyorhinis (where cell-culture enrichment is used, a fastidious strain such as ATCC 29052 is included)
  • Mycoplasma orale
  • Mycoplasma pneumoniae or M. gallisepticum
  • Mycoplasma synoviae (where there is use of or exposure to avian material during production)
  • Mycoplasma arginini
  • Spiroplasma citri (where there is use of or exposure to insect or plant material during production)

Um die Validierung durchzuführen, muss man mit Mycoplasmen-Referenzstämmen arbeiten. Diese werden in das eigene Material (Matrix) gespickt, also in bekannter Konzentration zugegeben. Im Vergleich mit einer Eichkurve bestimmt man dann z.B. die Wiederfindungsrate und Nachweisgrenze. Referenzstämme kann man bei verschiedenen Zellbanken und Stammsammlungen kaufen.

 

Die wichtigsten Zellkultur-Mykoplasmen sind

  • Mycoplasma orale
  • Mycoplasma hyorhinis
  • Mycoplasma arginini
  • Mycoplasma fermentans
  • Mycoplasma salivarium
  • Mycoplasma hominis